反向遺傳學研究方法精選(九篇)
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第1篇：反向遺傳學研究方法范文
關鍵詞 病毒學 方法 分子細胞水平
中圖分類號：G644 文獻標識碼：A
相對動物學或者植物學這些傳統學科，病毒學是一門始創于20世紀40年代的新興學科。雖然在此之前，就有發現能通過細菌過濾器的煙草花葉病致病因子的科學家D.Ivanofsky，以及發現具有濾過性的口蹄疫病原的科學家Loeffler和Frosch，但是基于歷史條件和知識水平的限制，人們或許觀察到了病毒引起的自然現象，卻無法對其產出真正科學的認識。
病毒學的里程碑事件應屬1935年美國科學家Stanley對于煙草花葉病毒的提純，使人們不再空泛地想象病毒的存在，而是真切地觀察和接觸到病毒，為今后的研究開辟了廣闊的道路。隨后，觀察手段，培養方法，以及相關的病理性研究手段的不斷提升，也使得病毒學這樣一門起步較晚的學科開始了飛速發展。
回顧病毒學研究的發展歷程，不難發現，學科的發展很大程度上依賴于技術的進步與革新，以及與相關學科的借鑒與學習。故了解和掌握病毒學方法技術的發展歷史以及技術要求，對于學科的研究，以及技術的創新，都有諸多裨益。
1 病毒鑒定檢測的相關方法技術
對于病毒最直觀的認識無疑是其生物學上特征，如病毒的理化性質（如病毒粒子的形態、大小、對理化因子的耐受性、特外存活期等）以及在寄主上的反應（如寄主范圍、癥狀表現、傳播方式等）。目前，病毒生物學特征的研究鑒定方法主要分為三大類：顯微成像技術（或相關針對病毒形態結構觀察的技術）、免疫-血清學檢測和分子生物學檢測。
1.1 病毒形態結構的觀察技術
眾所周知，病毒顆粒的大小遠小于普通細菌，所以對病毒最直觀的鑒定方法就是使用電鏡觀察，它可以直接地看到病毒的形態結構、存在與否。自第一臺電子顯微鏡的誕生，這門技術已為病毒學在內的多種生物學科作出了重要的貢獻，優點也十分明顯，操作簡便，快捷有效，所以，即使是在進入了分子研究水平的今天，電子顯微鏡仍然發揮著它不可替代的作用。
另外，在原始的技術基礎之上加以改進也形成了一些針對特殊觀察對象的電鏡技術，如電鏡負染技術和免疫電鏡檢測技術等。低溫電鏡技術，就是一種結合電鏡技術和低溫結晶觀察病毒的三維結構的技術，其優點不僅在于其分辨率更高，而且對于病毒樣品的損傷和失真的概率都大大減小，常用于極微量和高保真要求的病毒觀察檢測。
X-射線衍射技術是通過掃射病毒微晶得到的衍射圖像來分析還原原始的病毒結構，但為了保證衍射圖像的準確性，往往對樣品的純度和顆粒完整性要求較高，所以這種技術的使用范圍相對受限。
核磁共振技術，相對于前面提到的技術，對于操作的要求更低，運用范圍也更廣，但是對于結構的準確性判斷略低。此技術主要用于病毒短肽的分析以及蛋白小分子構象變化的研究。
1.2 免疫-血清檢測方法
此類技術的原理主要根據病毒的侵染性以及其作為白的特性而設計的。運用最為廣泛的還是血清學測試，即利用血清中可以和具有某種特定結構特征的病毒結合的抗體，從而進行病毒的定性定量分析。此法也廣泛應用用于醫學臨床的診斷，操作簡便，低廉有效。
酶聯免疫吸附實驗（ELISA）也是利用特異抗體吸附病毒顆粒的原理，只是在抗體上附帶了酶標記，從而使反應可以有顏色強弱的變化，利于定時定量監測病毒濃度。此法靈敏度高，且不受濃度范圍或其他抑制劑的干擾，也越來越多地應用于相關的生產實踐中。
免疫組化技術也是將抗體帶上特殊的顯色基團，使其游離時不顯色，而于抗原物質結合后顯色。利用這個特點，可以檢測特定組織中不同區域的病毒含量已經分布特點，利于進行組織性毒理分析。
1.3 分子生物學檢測方法
病毒寄生在宿主細胞內，但它又有不同于宿主細胞的特異基因組序列，特異序列的存在就說明病毒的存在，這就是分子生物學檢測病毒的原理。
聚合酶鏈式反應（PCR）是其中最為常用的一種檢測手段，其原理即利用DNA半保留復制的特點，以原始DNA為模板合成兩條一樣的雙鏈，從而達到擴增量指數增長，DNA總量可檢測的目的。另外，由于病毒的核酸有的是DNA，有的是RNA，所以常規的PCR以及反轉錄PCR即可針對不同的病毒基因進行檢測。
實時定量PCR與傳統PCR基本相同，只是在體系中加入熒光基團，反應中利用CCD實時讀取熒光信號，檢測。不僅減少的污染和浪費，也使定量快速而方便，可以實現多樣品和高通量的反應。
核酸原位雜交的原理是利用生物素編輯的cDNA探針來雜交組織中的樣本，從而確定病毒在宿主中的分布和載毒量。該技術，往往與免疫組化一起使用。
dsRNA技術是利用dsRNA在一定條件下與纖維素特異結合的性質，從來快速簡便的提取檢測出病毒顆粒中的dsRNA等，高效準確，在普通實驗室和生產工廠中都有所應用。
2 病毒的分離與培養的相關技術方法
2.1 病毒的提純技術
作為病毒學研究的重要技術前提，病毒的提純質量往往影響了后續一系列的步驟，所以其重要性不言而喻。由于病毒的生長特性、理化性質和宿主都差異頗大，提純的方法也不盡一致。
在病毒研究初期，沉淀法最常被使用，其主要利用病毒的蛋白外殼，改變溶劑性質，從而分離病毒粒子。相對而言簡便快速，但也常存在粗糙易變性的缺點。
色譜法源于化學中多組分的分離，由于生物成分的多樣性，也常使用該技術。色譜法主要分為吸附法、柱層析法和電泳法，都是利用較為溫和的環境，以及病毒的特異吸附或凝集等特質而設計的技術。種類繁多，應用廣泛。
超速離心利用樣品中不同成分擁有不同的沉降系數，在離心過程中，不同成分會在溶劑的特定位置形成區帶，從而達到分離提純的目的。此法常使用生物活性溶劑，且離心本身對病毒粒子損傷較小，故常用于理想的病毒快速分離技術。
2.2 病毒的獲取
最初的植物病毒學和動物病毒學的諸多研究都是建立在活的宿主體系上的，并且至今仍在應用，如生產不能體外繁殖的病毒、研究病毒感染的病理作用、檢測疫苗的安全性等。但動物宿主體系存在太多弊病，隨著細胞培養技術和分子生物學的發展，有逐漸被淘汰的趨勢。
現在，病毒的獲取主要是三種途徑：從宿主直接獲取、感染宿主擴增病毒、直接合成，其中后兩種途徑使用更為廣泛。
感染宿主擴增病毒即要使用到組織細胞培養，這項技術本來屬于細胞學的范疇，后由于動物源性或者細菌源性的病毒研究需求，此技術也越來越多地應用于病毒學的研究中。如，空斑分析最初用于測定噬菌體含量，而今也逐漸普及為動物病毒的研究中去。
直接合成法則是利用動物轉基因技術，將病毒的遺傳信息整合進目標動物中，在動物體內完成基因的表達，蛋白的合成，以及病毒的組裝等步驟。而動物轉基因技術也是現今生物領域的熱點內容，技術繁多，更新迅速，也為病毒的研究提供了良好的基礎。
3 病毒的功能機制研究的相關技術方法
3.1 病毒的遺傳學的研究
關于病毒遺傳學的研究和細菌等微生物的遺傳學研究技術相似，如PCR等。但是病毒的遺傳物質除了可能是DNA還可能是RNA，而且現在對于RNA病毒的研究居多，所以針對性的技術也與細菌等微生物的遺傳學研究技術有所區別。
對于RNA病毒使用最多的是反向遺傳學技術，最初即使用反轉錄PCR得到病毒RNA的cDNA，從而完成病毒基因組的探索工作，以達到了解或有目的性改造病毒基因組實現生產應用的目的。此法對于類型多樣的病毒研究提供的最為基礎的遺傳學數據，為疫苗開發篩選、新型病毒載體等多方面都給予有力的技術支持。
針對病毒易變異的特點，單鏈構想多態性檢測技術（SSCP）則理想地解決了這一問題。近年來，對于多種模式生物的基因組測序的發展，越來越多的研究開始著重于探索基因變異的問題，而SSCP技術正是這樣發展起來的。其主要用于檢測基因點突變和短序列的缺失和插入，為病毒的分子演化規律以及流行病學提供充分的證據。
基因芯片技術的概念來源于計算機芯片，即將大量寡聚核苷酸以陣列形式有序固定于載體表面，與待測樣本的病毒分子雜交，然后利用化學發光或同位素等顯色方法，用CCD等儀器對雜交信號進行高效檢測分析。主要用于病毒基因表達譜和基因多態性等方面的研究。
3.2 病毒表達機制的研究
在病毒的表達機制研究中，主要是利用不同的檢測手段，判斷病毒表達的具體情況，并對于病毒表達的情況進行總結歸納，研究其時空上的機制和規律。
Northern Blots即針對病毒RNA樣品的技術手段，原理與Southern Blots相似，利用探針與固相RNA雜交，再對探針分子的圖像進行捕獲和分析。此法特異性高，常用于分析已知基因的表達情況。
mRNA表達差異技術主要使用反轉錄PCR以及等量不同宿主的定量檢測，來確定抗病種和感病種的差異表達基因，從而進一步確定造成品種差異的原因。
3.3 病毒蛋白質的研究
病毒蛋白決定了病毒的形態結構，常作為抗原來激發人體內的免疫反應，作用于宿主細胞信號轉導途徑，導致宿主細胞內信號轉導發生紊亂；并且一些病毒蛋白具有酶的作用，可作為細胞毒素作用于宿主細胞。
大范圍而言，病毒蛋白質研究的技術，都隸屬于蛋白質組學的研究范疇之內，只不過針對不同特性的蛋白，往往會選取最為有效而簡便的技術方法進行研究。而由于蛋白質分子結構、化學生物特性等多方面差異很大的特點，其針對性技術也是五花八門，在此僅列舉較為常用的技術，以供研究者學習參考。
經典的方法有親和層析、抗體受體法、抗細胞受體法、抗獨特型抗體法、病毒覆蓋蛋白法。大多還是利用病毒蛋白和抗體蛋白或者其他蛋白或大分子物質的作用，來檢測病毒蛋白的特性。雖然這些方法快速簡便，但是由于方法本身較為粗糙，樣品用量較大，準確性存疑等問題，現在僅在低要求情況下使用。
現代的方法則更加豐富，也分別具有各自的特點，常被運用于現在的病毒蛋白的研究。
噬菌體表面呈現技術是利用噬菌體本身表達的兩種結構蛋白會暴露在噬菌體表面，故將外源基因倒入兩個結構蛋白基因間，使外源序列一起表達，然后讓表達產物與大量配體結合，篩選特殊結合性配體。但此法表達出來的蛋白可能與天然狀態不符，所以使用較為受限。
免疫共沉淀是一種成熟蛋白作用技術，其原理為在溶液或細胞中，用一種蛋白的抗體耦合可與此蛋白特異結合的另一蛋白，從而形成一抗體兩蛋白的沉淀，從而獲取具有結合餌蛋白能力的未知蛋白，探索細胞中蛋白作用機制。
酵母雙雜交技術是利用真核基因的特殊表達機制，通過將兩個蛋白的編碼序列整合在同一酵母細胞內的特殊轉錄激活域附近，若兩種蛋白可以發生相互作用，則會激活相應的報告基因，從而報告蛋白的相互作用。此法常用于篩選病毒蛋白的特異膜蛋白受體。
除了以上列舉的技術之外，還有cDNA文庫技術、質譜分析技術、GST Pull-down技術、串聯親和純化、熒光能量共轉移等多種技術應用于蛋白互作的研究。
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第2篇：反向遺傳學研究方法范文
【關鍵詞】 基質金屬蛋白酶9;RNA干擾;慢病毒載體
【Abstract】 Objective To explore the silencing effect of the constructed mice′s matrix metalloproteinase (MMP)9 RNA interference (RNAi) lentivirus vector in vitro. Methods 293T and NIH3T3 cells were cocultured by MMP9 overexpressed clone plasmid and RNAi lentivirus vector. Real time PCR and Western blot were adopted to observe the downregulation of MMP9 mRNA expression in 293T and NIH3T3 cells by RNAi. Results The constructed MMP9 RNAi lentivirus vector significantly decreased MMP9 expression in 293T and NIH3T3 cells. Conclusions RNAi lentivirus vector inhibiting MMP9 expression is successfully constructed， laying foundation for the research in vivo.
【Key words】 Matrix metalloproteinase (MMP)9; RNA interference; Lentivirus vector
動脈粥樣硬化(AS)斑塊破裂是急性缺血事件的主要原因。細胞凋亡和基質降解機制與斑塊破裂過程有關〔1〕。循環中細胞外基質(ECM)標記物的水平常常與AS疾病的危險分層密切相關。基質金屬蛋白酶(MMPs)降解ECM，破壞動脈壁的完整性，觸發急性動脈血栓形成〔2〕。MMPs是與ECM蛋白質降解密切相關的蛋白水解酶，在組織重塑過程中起重要作用〔3〕，是造成AS斑塊不穩定的重要原因之一。不穩定的人AS斑塊局部MMPs的主要來源為單核細胞/巨噬細胞，而MMPs的主要成分是MMP2和9〔4〕。因此，抑制MMP9在不穩定斑塊中的表達，可能抑制斑塊破裂。為此，本實驗構建小鼠MMP9 RNA干擾(RNAi)質粒，采用Western印跡和實時熒光定量PCR法，驗證MMP9干擾質粒在工具細胞中的沉默效應，為進一步在體研究奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料 由上海吉凱基因有限公司構建合成并包裝的MMP9 RNAi慢病毒載體;DMEN、胎牛血清(Gibco公司);胰蛋白酶(上海化學試劑公司);Lipofectamine2000、Trizol(美國Invitrogen公司);兔GFP多克隆(Abcam公司);山羊抗兔IgGHRP(Santa Cruz公司);預染的蛋白標志物(中晶公司);熒光顯微鏡(Olympus公司);實時熒光定量PCR儀器(BioRad公司)。
1.2 方法
1.2.1 Western印跡檢測293T細胞中MMP9表達 將構建好的MMP9基因過表達克隆質粒和針對不同靶點RNAi病毒載體質粒，共轉染入293T細胞，于轉染后72 h，收集培養上清行12%SDS聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，電轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用TBST(TBS+0.05%Tween20)加5%脫脂奶封閉過夜;用含5%脫脂牛奶的TBST稀釋與一抗相應的辣根過氧化物酶驢抗小鼠二抗(1∶4 000)，于室溫下孵育2 h，用Amersham公司ECL+plusTM Western印跡試劑盒檢測蛋白表達。
1.2.2 實時熒光定量PCR檢測NIH3T3細胞中MMP9 mRNA的表達 NIH3T3細胞慢病毒感染實驗在6孔板中進行，分為正常對照組、陰性對照組和RNAi組。MMP9基因引物采用Beacon designer 2軟件設計，上游引物：GGCGTGTCTGGAGATTCG，下游引物：TACTGGAAGATGTCGTGTGAG;分別取轉染后的NIH3T3細胞，按Invitrogen公司的Trizol操作說明書抽提細胞總RNA;RNA逆轉錄獲cDNA，在Biorad的iQ5上完成實時熒光定量PCR檢測。
1.2.3 熒光顯微鏡觀察GFP表達 將生長狀態良好的NIH3T3，在病毒感染前一天分入6孔培養板培養，感染當天按實驗設計的組別分別加入不同復合感染(MOI)的RNAi慢病毒顆粒進行感染實驗。感染72 h后熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況，進而判斷MMP9的干擾效果。
1.3 統計學處理 采用SPSS11.0統計軟件進行χ2檢驗。
2 結 果
2.1 293T細胞中Western印跡鑒定慢病毒介導的RNAi 于轉染后72 h，收集培養上清作Western印跡檢測，利用0.25和0.5 μg兩種不同質粒濃度進行實驗。1#、2#、3#這三種不同干擾靶點的敲減作用不同，2#對MMP9有顯著的敲減作用，在兩個質粒濃度下的作用是一致的;3#也有一些敲減作用，特別是在高質粒濃度下;1#靶點基本沒有作用，如圖1。
PC為MMP9陽性參照;NC1為共轉染過表達融合蛋白質粒，加NC RNAi質粒的細胞組;NC2為針對鼠源GAPDH的有效干擾載體，作為第二個陰性對照;1#、2#、3# 為共轉染過表達融合蛋白質粒，不同靶點加RNAi質粒的細胞組
圖1 Western 印跡檢測293T細胞中RNAi作用
2.2 實時熒光PCR定量檢測NIH3T3中MMP9 mRNA的干擾作用 分別提取轉染后的NIH3T3細胞總RNA，利用實時熒光PCR定量分析各組MMP9 mRNA表達量的變化。RNAi組MMP9 mRNA相對表達量為0.25，陰性對照組為1.00，正常對照組為1.52。RNAi組在NIN3T3細胞上對MMP9 mRNA基因表達有顯著干擾作用，干擾效率75%以上，與其他兩組比較有顯著差異(P
2.3 NIH3T3細胞感染病毒的熒光觀察 慢病毒載體上帶有GFP綠色熒光基因標記，在488 nm藍光照射下可激發出507 nm的綠色熒光。感染72 h后在熒光顯微鏡下可見，陰性對照組幾乎100%的NIH3T3細胞都可發出綠色熒光，說明MMP9過表達質粒大量轉染入NIH3T3細胞;慢病毒介導的RNAi組綠色熒光表達明顯減少，說明慢病毒介導的RNAi能夠有效抑制MMP9表達。見圖2。
圖2 RNAi靶點驗證熒光圖
3 討 論
基因治療的關鍵在于篩選有效基因、構建高效表達載體、定位靶向治療。以往實驗研究中常用的載體有腺病毒和逆轉錄病毒載體。腺病毒載體是基因治療常用的病毒載體，具有感染能力強、滴度高、多拷貝高效性、無插入突變性等優點〔5〕，但是目的基因不能整合至靶細胞基因組，僅能短暫表達，且反復應用容易引起免疫反應。逆轉錄病毒載體雖然可以使目的基因整合至靶細胞基因組，實現穩定表達，但只能轉導分裂期細胞，不能轉導非分裂期細胞。慢病毒載體來源于人類免疫缺陷病毒1(HIV1)，具有可感染非分裂期細胞、容納外源性目的基因片段大、免疫反應小等特點，因此越來越受到人們重視。
RNAi是雙鏈RNA分子在mRNA水平上誘發的序列特異性轉錄后基因表達沉默〔6，7〕。作為一種反向遺傳學手段，RNAi廣泛應用于基因功能分析、信號轉導通路研究和基因治療之中。由于慢病毒載體介導的RNAi 作用時間持久，不易誘發宿主免疫反應，因此慢病毒成為基因治療載體研究的熱點。 用慢病毒載體介導RNAi的研究〔8～10〕顯示，該技術在基因功能和基因治療等領域具有廣泛的應用前景。
MMPs是活性依賴于內源性Zn2+及Ca2+的存在、主要由平滑肌細胞和巨噬細胞分泌和表達的一類蛋白水解酶，目前發現有16種以上。Peter等〔11〕的研究顯示，巨噬細胞過表達活化的MMP9時顯著增加彈力蛋白的降解，誘導有效的斑塊破裂。因此，抑制MMP9的表達可能對AS的進程及不穩定斑塊的破裂產生重要影響。
本實驗以MMP9為干擾靶點構建的慢病毒載體，在生長狀態良好的工具細胞中，通過Western印跡和實時熒光定量PCR驗證其靶點的有效性，結果顯示構建的慢病毒載體能夠有效敲減工具細胞中MMP9表達。這為以后的動物體內基因治療研究奠定了基礎。
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第3篇：反向遺傳學研究方法范文
關鍵詞：小麥；白粉病；WRKY；VIGS
中圖分類號：S512 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.05.001
Abstract：WRKY transcription factor family can help improve plant stress tolerance， which widely exist in various plants. After TaWRKY gene was silenced by VIGS method， it was found that the proportion of succeed Bgt inoculation increased， and the percentage of abnormal appressoria declined， such as papilla. The results indicated that TaWRKY gene played an important role in wheat- Bgt interaction.
Key words：wheat； powdery mildew； WRKY； VIGS
小麥白粉病是由布氏白粉菌（Blumeria graminis f. sp. Tritici）侵染所引起的真菌感染性病害，如遇高溫多濕天氣病害流行，會使小麥嚴重受害，導致減產13%～34%[1]。 因此，科學家一方面通過抗病育種，不斷培育新的抗病小麥品種來抵御病害，另一方面通過深入的抗病分子機理研究，克隆抗病相關基因、弄清抗病信號通路以及基因工程等技術手段，以達到抗病分子育種的目的。
轉錄因子可以與真核基因啟動子區中的順式作用元件互作，激活或抑制多個下游功能基因轉錄，從而使植株獲得綜合改良效果。研究表明，WRKY轉錄因子家族幾乎存在于所有植物中，它們共同含有一段高度保守氨基酸序列WRKYGQK[2]。WRKY廣泛參與植物種子萌發與休眠、開花、代謝、激素信號轉導，還參與抵御生物和非生物脅迫等反應過程。擬南芥AtWRKY33基因直接調控了植物抗毒素Camalexin 的合成[3]，并且調控大量抗病相關基因的表達[4]。大豆中GmWRKY58和GmWRKY76的過表達會造成作物提早開花，表達量的區別對花形態造成不同影響[5]。水稻中OsWRKY6基因的過表達有助于提高作物對病原菌的抗性，同時可直接調控異分支酸合成酶的表達從而增加水楊酸的濃度實現自我調節[6]。小麥（Triticum aestivum）TaWRKY93可調節作物對滲透壓、高鹽、干旱和低溫等脅迫的耐性[7]。迄今為止，研究人員已經在大麥[8]、擬南芥[9]、大豆[10]和水稻[11]等多種植物中都鑒定到不同數量的WRKY轉錄因子。
病毒誘導基因沉默（VIGS-induced gene silencing， VIGS）是引起內源mRNA特異性降解、引起基因轉錄沉默的技術。VIGS試驗周期短，操作簡便，并且無需轉化。近年來，在植物基因功能研究中，VIGS技術作為一種簡單、快速、高效的反向遺傳學技術在禾本科植物基因功能研究中發揮了重要作用[12-13]。
本研究以前期工作獲得的TaWRKY基因為基礎[14]，利用VIGS技術獲得沉默植株，通過對基因沉默前后白粉菌侵染情況進行觀察統計，最終確定TaWRKY基因在小麥抗白粉病過程中的功能。
1 材料和方法
1.1 試驗材料與試劑
抗白粉病品種Brock，由Ray Johnson博士惠贈。
小麥白粉菌15號生理小種，由中國農業科學院植物保護研究所提供。
1.2 沉默TaWRKY的VIGS載體構建
在目的基因核苷酸序列的非保守區，設計上、下游特異性沉默引物TaWRKY-VIGS-F和TaWRKY-VIGS-R，以抗病小麥Brock總RNA合成的cDNA為模版，擴增富集沉默片段，將該片段與BSMVγ：連接構建重組載體BSMVγ：TaWRKY，構建過程參見Li 等[15]。
1.3 基因沉默效率檢測
通過限制性內切酶酶切線性化、體外轉錄后，獲得病毒RNA組分通過摩擦接種方法接種到小麥第2葉上，待接NH2O（對照1）、BSMV：GFP（對照2）和BSMV： TaWRKY組小麥第3葉伸展完全，采用抖拂法對各株植株第3葉均勻高密度接種新鮮白粉菌孢子，在相應時間點取葉片，利用半定量PCR方法檢測這3組植株中TaWRKY基因的mRNA水平的水平變化，從而確定TaWRKY基因沉默的效率。
1.4 基因沉默后對小麥抗白粉病表型的影響
取接種48，72 h和7 d后的小麥葉片，用考馬斯亮藍染色方法染色并觀察統計白粉菌孢子的生長發育情況，通過與對照白粉菌孢子萌發、畸形胞比例等的對比分析，確定目標基因在抗白粉病過程中的貢獻。
2 結果與分析
2.1 VIGS沉默載體構建
根據已獲得TaWRKY基因序列，在基因的非保守區設計添加了NheI識別序列的引物WRKY-V-F（AGCCGCAGCAGCAGAACG）、WRKY-V-R（CTTGAAGCTGGGGTCCCTC）。以含TaWRKY基因序列的重組質粒作為模板，擴增用于構建BSMV重組載體的目的基因片段，擴增結果如圖1所示。目的片段大小約為250 bp左右，隨后將回收后的目的片段進行酶切形成粘性末端，BSMV載體同樣經過酶切回收，與目的片段進行連接，通過進一步篩選、驗證，挑選陽性克隆送測驗證。
2.2 VIGS技術沉默靶基因后TaWRKY表達水平檢測
在TaWRKY基因的特異性核苷酸序列區段設計引物，擴增一個長227 bp的片段構建TaWRKY基因沉默載體BSMVγ：TaWRKY。本次沉默試驗共設置4個組別，分別為H2O對照組（空白對照）、BSMV：GFP對照組（陽性對照）、BSMV：PDS對照組（沉默PDS基因）、BSMV： TaWRKY試驗組（沉默目的基因TaWRKY）。為了驗證本試驗所建立的沉默體系成功有效，分別對各組摩擦接種后約15 d的小麥第3葉進行表型觀察，結果如圖2所示。除BSMV：PDS對照組葉片發生明顯白化現象之外，其他組葉片均呈綠色，說明該基因沉默體系構建成功。
2.3 TaWRKY基因沉默效率驗證
為了進一步證實TaWRKY基因是否被有效沉默，采用半定量PCR的方法，對沉默后各組植株中TaWRKY基因的轉錄水平進行了檢測，結果如圖3所示。從圖中可以看出，摩擦接種后，TaWRKY試驗組的mRNA水平明顯低于H2O和GFP對照組，說明小麥內源TaWRKY基因被有效沉默了。另外，在接種重組病毒BSMV：GFP后，TaWRKY基因的表達也有輕微下調，該現象可能是由于病毒的侵染對植株造成了影響。
2.4 TaWRKY基因沉默植株抗病分析
為了進一步研究TaWRKY基因在小麥葉片與白粉菌的互作過程中所起到的調控作用，本研究使用考馬斯亮藍染色法分別對接種48，72 h和7 d后的GFP組、TaWRKY組小麥植株的第3葉進行固定、染色、制片，在顯微鏡下進行鏡檢，觀察各時間點中，白粉菌萌發形態及生長狀態，如圖4所示。從圖4中可以看出：染菌48 h后，TaWRKY組白粉菌孢子萌發狀態優于對照組，孢子萌發，芽管伸長，形成附著胞；染菌72 h后，TaWRKY試驗組白粉菌孢子大量萌發形成次生菌絲，而各對照組中，孢子萌發出現分瓣型畸形附著胞、纖細型畸形附著胞等；染菌7 d后，TaWRKY試驗組白粉菌孢子大量生成串珠狀分生孢子，而各對照組中，僅有少量孢子萌發形成次生菌絲。
在鏡檢觀察孢子發育結構的同時，統計各個視野內白粉菌孢子萌發率、畸形率、寄主抗性等參數。統計結果如圖5、圖6所示。由圖可以得出，接種白粉菌48 h后，白粉菌對TaWRKY基因沉默后的植株侵染成功率增加，畸形附著胞比例下降，與GFP對照組相比，TaWRKY基因沉默組植株白粉菌孢子萌發率上升，畸形附著胞（分瓣型附著胞、纖細型附著胞等）比例下降。
3 結論與討論
自1994年，Ishiguro和Nakamura[16]首次母適恚Ipomoea batatas）中克隆出第一個WRKY蛋白SPF1，研究人員對于植物WRKY轉錄因子家族開展了大量研究。越來越多的研究結果表明，WRKY 蛋白在植物生長發育，抵御生物以及非生物脅迫等多種生理生化過程中發揮重要作用[17]。前期工作中，筆者在小麥Brock中分離到一個WRKY類轉錄因子基因TaWRKY，并初步證實該基因參與了小麥的白粉菌脅迫應答反應，但還不能夠較確切了解TaWRKY基因與小麥抗白粉病之間的關系[12]。
關于病毒介導的基因沉默技術已經廣泛地應用于基因功能研究[18-21]，但該方法由于涉及到病毒感染，從而影響對正確結果的判斷而備受爭議。本研究為了降低這種系統誤差，采取了3個對照組，即用GKP緩沖液作為摩擦接種介質為陰性對照，用綠色熒光蛋白基因構建γ載體BSMVγ：GFP、編碼葉綠素關鍵酶基因PDS基因構建γ載體BSMVγ：PDS為兩個陽性對照組。結果發現：GKP緩沖液和GFP對照組生長正常，沒有病毒侵染后留下的病斑，生長正常，說明病毒對葉片生長沒有明顯影響；PDS組出現了葉片白化現象，說明PDS基因被有效沉默，表明基因沉默系統可用；基因沉默后再接種白粉菌孢子7 d后，白粉菌孢子充分萌發。與GFP組相比，TaWRKY基因沉默組小麥葉片表面的白粉菌附著胞畸形率明顯下降，白粉菌的成功侵染率顯著上升。因此，推測TaWRKY基因可能在小麥抗白粉菌反應中發揮著重要作用。
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